豬僞狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒使用說明
【試劑盒簡介】
豬僞狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒，采用聚合酶鍊反應(PCR)技術檢測豬血清和組織中的PRV，适用于PRV的檢測、診斷和流行病學調查。
【原理】
提取DNA作為模闆，在DNA聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環，使特異DNA片段的拷貝數放大數百萬倍。将擴增的DNA片段進行電泳、染色後，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴增帶。
【試劑盒組份】
| 1. 裂解液 | 8mL | 8. 陽性對照 | |
| 2. 蛋白酶K | 110μL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
| 3. 抽提液 | 8mL | 10. PCR 反應液A | 180μL |
| 4. 異丙醇 | 7mL | 11. PCR 反應液B | 50μL |
| 5. 洗滌液 | 12mL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
| 6. 無菌水 | 500μL | 13. 染色液 | |
| 7. 陰性對照 | 300μL | | 10μL
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注：塑料袋内試劑(陽性對照、蛋白酶K、PCR反應液A和B)-20 ℃凍存，其他室溫保存。
黃曲黴毒素M1檢測試劑盒(酶免)
三聚氰胺檢測試劑盒(酶免)
磺胺二甲基嘧啶檢測試劑盒(酶免)
孔雀石綠定量檢測試劑盒(酶免)
金黴素定量檢測試劑盒(酶免)
【豬僞狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒操作方法】
一、病毒DNA的提取
1.取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分别加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃動，不要吸到上層保護液)，用力颠倒10次混勻，12,000rpm離心10min。
2.取500µL上清置于滅菌離心管中，加入500µL異丙醇，混勻，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管，室溫融化，13,000rpm離心15min。
3.棄上清，沿管壁緩緩加入1mL洗滌液，輕輕旋轉一周後倒掉，将離心管倒扣于吸水紙上1min，再将離心管真空抽幹15min或37℃烘幹。
4.用30µL無菌水溶解沉澱，作為模闆備用。
二、樣品制備
1.樣品采集：病死或撲殺的豬，取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物，置于50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴禁反複凍融。)
2.樣品處理：
2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然後将樣品轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻後37℃溫育1h。
2.2全血樣品的處理：待血凝後取血清放于離心管中，8000rpm離心5min，取上清100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻後37℃溫育1h。
2.3陽性對照的處理：混勻後取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻後37℃溫育1h。
2.4陰性對照的處理：混勻後取100µL于1.5mL滅菌離心管中，加入500µL裂解液和10µL蛋白酶K，混勻後37℃溫育1h。
三、PCR
1.反應體系：分别取16µLPCR反應液A(用前混勻)、2µLPCR反應液B(用前混勻)和2µL模闆DNA，混勻。
2.反應程序：在PCR儀上運行以下程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35個循環；72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳：待膠凝固後，取5µLPCR擴增産物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻後将膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結果。
【結果判斷】
陽性對照出現400bp擴增帶，陰性對照無帶出現(引物帶除外)時，實驗結果成立。被檢樣品出現400bp擴增帶為豬僞狂犬病毒陽性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【豬僞狂犬病毒實時熒光PCR試劑盒注意事項】
1.本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應在規定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用後立即放回。
